Đến giữa năm 1963, anh Trỗi được anh Lê Đức Hiền (Tư Kiếm, tên thật là Nguyễn Hữu Kiếm), anh họ nhận vào tổ biệt động cùng lúc với Nguyễn Hữu Lời. Cả bốn người cùng quê ở làng Thanh Quýt và lúc đó đều cư ngụ ở quanh vùng Vườn Xoài, đường Trương Minh Giảng. Thời gian này, anh Trỗi ở tại nhà Tư Kiếm.

Đến tháng 10 năm 1963, Nguyễn Văn Trỗi tranh thủ về thăm quê, đây là lần thăm nhà cuối cùng của anh. Dịp này anh ghé thăm thầy giáo Nhung, theo lời kể của thầy, lúc đó anh đã dùng gai bồ kết khắc lên cây cau trước nhà thầy: “15.10.1963”, sau đó vào lại Sài Gòn.

Đầu năm 1964, nhân dịp Tết, Tư Kiếm đã bố trí cho anh Trỗi và Nguyễn Hữu Lời ra căn cứ ở Rừng Thơm (nay thuộc huyện Đức Hòa, tỉnh Long An) gặp Ban chỉ huy cánh tây nam, hai anh ở lại căn cứ 3 ngày, coi như dự lớp chính trị ngắn ngày, kết hợp học một số “miếng” võ hiểm để phòng thân.

Từ căn cứ về, anh Trỗi chọn ngay mục tiêu “đánh thí điểm” là cư xá Mỹ ở đường Cao Thắng. Sau khi báo cáo, kế hoạch của anh được đồng chí Tư Đạt - Chính trị viên cánh tây nam cho phép và tặng một quả lựu đạn da láng của Mỹ. Bằng quả lựu đạn này và cách đánh thông minh của mình, anh đã tiêu diệt gọn bốn tên Mỹ và làm bị thương tám tên. [9]

Sau đó anh tìm hàng loạt mục tiêu như tàu hải quân Mỹ đóng tại bến Bạch Đằng, nhà máy điện... để xin đánh, nhưng tổ chức không cho mà chuẩn bị kế hoạch khi Bộ trưởng Quốc phòng Mỹ Robert McNamara đến miền Nam Việt Nam.[10][11]

Đội Biệt động thành Sài Gòn 65 lúc đó đa số là cán bộ của đội Quyết tử thành chín năm chống Pháp còn sống sót. Họ trở thành bộ phận tham mưu chỉ đạo đánh nguỵ Sài Gòn. Mỗi khi họp các tổ, có khi ba người, có khi năm người thì chỉ có những người đó biết thôi vì hoạt động trong lòng địch. Với điều kiện như vậy, trong tổ chỉ lấy ra bốn người là Lê Đức Hiền (Tư Kiếm) làm tổ trưởng, anh Nguyễn Hoàng Sơn (anh của anh Lê Đức Hiền) làm tổ phó, Nguyễn Hữu Lời và Nguyễn Văn Trỗi có trong tổ nhận nhiệm vụ ám sát McNamara.